Cantidad de Inserto Requerida:
¿Cuánto inserto necesitas pipetear para tu reacción de ligación? Acertar la proporción molar entre vector e inserto es una de las variables que más afecta la eficiencia de clonación. La calculadora de ligación de arriba convierte tu ratio molar deseado en una cantidad de inserto en nanogramos, lista para pipetear.
¿Qué es la calculadora de ligación?
Es una herramienta que, a partir del tamaño y cantidad de tu vector, el tamaño de tu inserto y el ratio molar que quieres usar, calcula cuántos nanogramos de inserto agregar a la reacción de ligación, además de sugerir un protocolo estándar con T4 DNA ligasa.
¿Por qué importa el ratio molar en la ligación?
- Un exceso molar de inserto favorece que el vector se ligue con el inserto en lugar de religarse consigo mismo (autoligación/religación vacía).
- Un ratio demasiado alto puede favorecer la formación de concatémeros (múltiples insertos en un mismo vector).
- Trabajar en masa (ng) en vez de en moles es más práctico en el laboratorio, pero requiere ajustar por la diferencia de tamaño entre vector e inserto, que es justamente lo que hace esta calculadora.
¿Cómo se calcula la cantidad de inserto?
La fórmula ajusta la cantidad de inserto necesaria considerando que, a igual masa, un fragmento más pequeño tiene más moléculas por nanogramo que uno más grande:
Cantidad de inserto necesaria:
ng de inserto = ng de vector × (kb de inserto / kb de vector) × ratio molar (inserto:vector)
Donde el ratio molar (inserto:vector) es la proporción de moléculas de inserto por cada molécula de vector que quieres en la reacción (normalmente entre 1:1 y 5:1).
Ejemplo resuelto: vector de 5 kb con inserto de 1.5 kb
Supongamos 50 ng de vector de 5.0 kb, un inserto de 1.5 kb, y un ratio molar deseado de 3:1 (inserto:vector).
🧬 Cálculo paso a paso
Es decir: para ligar 50 ng de este vector con un ratio molar 3:1, necesitas agregar 45 ng de inserto a la reacción.
Ratios molares típicos a probar
| Ratio molar (inserto:vector) | Cuándo usarlo |
|---|---|
| 1:1 | Punto de partida conservador; útil cuando el inserto es escaso. |
| 3:1 | Ratio más común como primera prueba en la mayoría de clonaciones. |
| 5:1 o mayor | Cuando la eficiencia de ligación es baja o el inserto es difícil de clonar. |
Una práctica habitual es montar varias reacciones en paralelo con distintos ratios (ej. 1:1, 3:1 y 5:1) y quedarse con la que dé más colonias, en lugar de asumir que un único ratio funcionará mejor.
Protocolo estándar de ligación con T4 DNA ligasa
- Volumen total de reacción: 10-20 μL.
- T4 DNA ligasa: ~1 μL (según unidades del fabricante).
- Buffer de ligación (10×): 1/10 del volumen final (ej. 2 μL en una reacción de 20 μL).
- Incubación: 16°C durante 4-16 horas (overnight es común), o 25°C durante 1-2 horas para extremos cohesivos simples.
- Control negativo: siempre incluye una reacción sin inserto para estimar el fondo de religación del vector.
Preguntas frecuentes
¿Por qué se ajusta por el tamaño en kb del inserto y del vector?
Porque el número de moléculas en una masa dada de ADN depende de su tamaño: un fragmento pequeño tiene muchas más moléculas por nanogramo que uno grande. Ajustar por la relación de tamaños permite trabajar directamente en masa (ng) manteniendo el ratio molar deseado.
¿Qué ratio molar debería probar primero?
3:1 (inserto:vector) es el punto de partida más común. Si la eficiencia de transformación resulta baja, conviene repetir con ratios de 1:1 y 5:1 en paralelo para comparar.
¿Qué significa un alto fondo de religación en el control negativo?
Indica que el vector se está recircularizando sin insertar el fragmento de interés, comúnmente por un corte de restricción incompleto o por extremos compatibles que permiten la religación. Tratar el vector con fosfatasa alcalina puede reducir este problema.
¿Esta fórmula aplica igual para clonación con enzimas de restricción y para ensamblaje tipo Gibson?
La fórmula de ratio molar en masa aplica de forma general a cualquier método que requiera una proporción molar definida entre fragmentos, aunque los protocolos de temperatura, tiempo y enzima cambian según el método de ensamblaje usado.